IITC MRBP鼠尾血压监测仪：痰湿壅盛型高血压病小鼠模型的血浆代谢组学分析

山东中医药大学杨传华团队发表了一项研究，题为“基于UPLC-MS探讨痰湿壅盛型高血压病小鼠血浆代谢组学特点"。研究通过检测痰湿壅盛型高血压病模型小鼠的血浆代谢组学变化，挖掘该证候的潜在生物学标志物，从整体角度阐释痰湿壅盛型高血压病模型小鼠的代谢特征。

摘要

目的：通过检测痰湿壅盛型高血压病模型小鼠的血浆代谢组学变化，分析挖掘该证候的潜在生物学

标志物，从整体角度阐释痰湿壅盛型高血压病模型小鼠的代谢特征。方法：高脂饲料喂养C57BL/6Cnc小鼠25周， 观察小鼠一般情况和主动脉组织形态，UPLC-MS分析血浆代谢组变化，结合多维统计和单位统计分析筛选组间差 异代谢物，并进行KEGG代谢通路富集分析。结果：模型组小鼠出现痰湿壅盛证特征表现，体质量、Lee’s指数、 收缩压、舒张压、血糖/胰岛素、瘦素水平较对照组显著升高（P<0.05），空腹胰岛素显著降低（P<0.05），主 动脉出现明显的形态改变和脂质沉积。UPLC-MS共筛选出差异代谢物125个（其中64个升高，61个降低；VIP>1且 P<0.05），差异最大的代谢物依次为磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、L-异亮氨酸、乙酰肉碱等。差异代谢物主要富集于胆碱代谢、GnRH信号通路、氨基酸的合成、FcγR介导的吞噬作用、磷脂酶D信号途径等（P<0.01），以及产热、EGFR信号通路、NF-κB信号通路等（P<0.05）。结论：磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、L-异亮氨酸、乙酰肉碱可作为痰湿壅盛型高血压病小鼠模型的特征血浆代谢标志物。

实验材料与仪器

实验动物：8周龄SPF级雄性C57BL/6Cnc小鼠27只，体质量（22±2）g

高脂饲料配方：基础饲料83.75%，15%脂肪，1.25%胆固醇。

试剂：水合氯醛、甲醇、甲酸、水、乙腈、L-2-氯苯丙氨酸、LysoPC17:0、其他所有试剂均为分析纯或色谱级。

仪器：IITC MRBP鼠尾血压监测仪、QE高分辨质谱仪、Nexera UPLC高效液相色谱仪、Acquity UPLC BEH C18色谱柱、TYXH-I漩涡振荡器、TGL-16MS台式高速冷冻离心机。

IITC MRBP鼠尾血压监测仪

实验过程

小鼠一般情况观察与模型判定：每日观察小鼠一般情况；每周记录小鼠体质量、身长（鼻尖至尾根），计算Lee‘s指数≡体质量（g）1/7×10/体长（cm）；每周清醒状态下尾动脉加压法检测小鼠血压，设定保温桶温度32℃，平衡稳定5~10min，间隔40s，连续测量3次，取平均值。25周后，以体质量、血压均≥对照组平均值25%者作为判定“痰湿壅盛型高血压病小鼠模型"成功的标准，筛选9只纳入模型组，为避免极值，再进一步淘汰此9只小鼠中体质量大和小的各1只，共纳入7只模型小鼠进行后续实验，其余淘汰过量麻醉处死。

样本采集及主动脉组织形态观察：25周后，10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，下腔静脉取血，EDTA抗凝，室温下3500r/min离心（离心半径：7.8cm）15min，取上清液。化学法检测小鼠空腹血糖、空腹胰岛素、瘦素含量，由山东中医药大学附属医院检验科进行检测。冰上分离小鼠主动脉，分为2份：一部分以10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度4μm，苏木素-伊红（HE）染色观察组织学改变；另一部分以2.5%戊二醛固定，透射电镜观察主动脉亚细胞水平形态变化，电镜样品制备和观察委托山东微亚生物科技有限公司进行。

血浆样品前处理：100μL血浆加入内标（L-2-氯苯丙氨酸，0.3mg/mL；LysoPC17:0，0.01mg/mL，均为甲醇配置）10μL涡旋震荡10s，加入300μL甲醇-乙腈（V:V=2:1），涡旋震荡1min，超声提取10min，-20℃静置30min；室温下13000r/min离心（离心半径：7.8cm）10min，取300μL上清液挥干，400μL甲醇-水（V:V=1:4）复溶，涡旋30s，超声2min，室温下13000r/min离心（离心半径：7.8cm）10min，取上清液，以0.22μm有机相针孔过滤器过滤。质控样本（QC）由所有样本的提取液等体积混合而成。

液相色谱-质谱分析：采用Nexera UPLC超高效液相串联QE高分辨质谱仪组成的液质联用系统。色谱条件：Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；柱温：45℃；流动相：A-水（含0.1%甲酸），B-甲醇；流速：0.35mL/min；进样体积：10μL。梯度洗脱：0min时A 95%、B 5%；1.5min时A 95%、B 5%；5.0min时A 70%、B 30%；7.0min时A 30%、B 70%；10.0min时A 1%、B 99%；12.0min时A 1%、B 99%；15.0min时A 95%、B 5%。质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）；样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式。质谱参数：质量扫描范围：60~900；分辨率（full scan）：70000；分辨率（HCD MS/MS scans）：17500；喷雾电压：3.5kV（正离子），3.1kV（负离子）；鞘气流速：30Arb；辅助气流速：10Arb；毛细管温度：320℃。

数据处理：UNIFI 1.8.1软件用于原始数据的采集。原始数据经Progenesis QI v2.3软件（Nonlinear Dynamics）进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化。化合物的鉴定基于精确质量数、二级碎片以及同位素分布，使用The Human Metabolome Database（HMDB）和Lipidmaps（v2.3）以及METLIN数据库进行定性。根据化合物定性结果打分（Score）进行筛选，筛选标准为≥30分（满分60分），将正负离子数据合并成一个数据矩阵。采用无监督的主成分分析（PCA）来观察各样本之间的总体分布，有监督的偏最小二乘法分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）来区分各组间的总体差异。采用七次循环交互验证和200次响应排序检验（RPT）考察模型的质量，综合对比结果，多维分析和单维分析相结合，筛选组间差异代谢物。并基于KEGG数据库对差异代谢物进行代谢通路富集分析，以挖掘两组样本中代谢途径变化机制。

实验结论

经高脂饲料长期喂养的小鼠，最终建立了痰湿壅盛型高血压病小鼠模型。UPLC-MS筛选出125个血浆差异代谢物，差异最大的代谢物（VIP排序）依次为磷脂酰胆碱、三氯乙醇葡萄糖醛酸、溶血磷脂酰胆碱、L-异亮氨酸、乙酰肉碱等。模型组小鼠血浆中多种磷脂酰胆碱水平升高，磷脂酰胆碱（16:0/0:0）升高了1.853倍，磷脂酰胆碱[0-16:1(11Z)/2:0]升高了2.513倍，磷脂酰胆碱[16:0/9:0(COOH)]升高了2.133倍，磷脂酰胆碱[22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0:0]升高了1.904倍。模型组小鼠多种溶血磷脂酰胆碱升高，溶血磷脂酰胆碱[18:2(9Z,12Z)]升高了2.166倍，溶血磷脂酰胆碱[18:1(9Z)]升高了2.260倍，溶血磷脂酰胆碱[20:3(5Z,8Z,11Z)]升高了3.324倍，溶血磷脂酰胆碱[18:3(9Z,12Z,15Z)]升高了2.917倍。L-异亮氨酸下调了5.128倍（1/0.195）。乙酰肉碱升高了1.960倍。痰湿壅盛型高血压病小鼠模型组与对照组比较，差异代谢物多集中于脂类小分子，磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、L-异亮氨酸、乙酰肉碱可作为痰湿壅盛型高血压病模型小鼠的特征代谢标志物。

参考文献

1. Tang W H, Wang Z, Levison S, et al. Intestinal microbial metabolism of phosphatidylcholine and cardiovascular risk. N Engl J Med, 2013, 368(17):1575-1584.

2. Nie C, He T, Zhang W, et al. Branched chain amino acids: Beyond nutrition metabolism. Int J Mol Sci, 2018, 19(4):954.