基于经皮水分流失测量仪评估雪腐镰刀菌烯醇对AD小鼠皮肤屏障功能的影响

2024年4月，Tomoki Fukuyama团队在《Archives of Toxicology》期刊上发表了题为“Subacute oral exposure to lowest observed adverse effect level of nivalenol exacerbates atopic dermatitis in mice via direct activation of mitogenactivated protein kinase signal in antigenpresenting cells"的研究论文。该研究探讨了霉菌毒素雪腐镰刀菌烯醇（Nivalenol,NIV）的免疫毒性作用，重点关注其对抗原呈递细胞的影响及其在特应性皮炎（AD）小鼠模型中的作用。

摘要

本研究使用抗原呈递细胞和特应性皮炎（AD）小鼠模型，调查了霉菌毒素雪腐镰刀菌烯醇（NIV）的免疫毒性作用。体外实验使用小鼠巨噬细胞系（RAW 264.7）和小鼠树突状细胞系（DC 2.4）。细胞暴露于NIV（0.19-5μmol）24小时后，定量检测了促炎细胞因子（IL-1β、IL-6和TNFα）的产生。为研究炎症细胞因子产生通路，使用MAPK抑制剂和磷酸化分析，探究了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路（如ERK1/2、p-38和JNK）在NIV暴露中的可能参与。此外，在半抗原诱导的AD NC/Nga小鼠模型中，评估了低浓度（1或5 ppm）NIV口服暴露的促炎作用。体外实验表明，暴露于NIV会促进TNFα的产生。此外，使用MAPK抑制剂预处理后，TNFα的产生受到抑制，这表明NIV直接诱导了MAPK的磷酸化。与对照组相比，口服NIV暴露加剧了AD症状，包括耳廓淋巴结中辅助T细胞和产生IgE的B细胞数量增加，以及促炎细胞因子（如IL-4、IL-5和IL-13）分泌增多。研究结果表明，暴露于NIV直接增强了ERK1/2、p-38和JNK的磷酸化，导致抗原呈递细胞中TNFα产生增加，这与特应性皮炎的发展密切相关。

材料与仪器

主要材料：

实验动物：雌性NC/Nga小鼠（7周龄）。

实验材料：

雪腐镰刀菌烯醇（NIV）、小鼠树突状细胞系（DC2.4）、小鼠巨噬细胞系（RAW264.7）、TDI、抑制剂、抗体、细胞培养基、胎牛血清、T细胞活化磁珠等。

主要仪器：

酶标仪、实时荧光定量PCR系统、流式细胞仪、Western blot成像系统、ASCH VAPO SCAN经皮水分流失测量仪、细胞计数仪、匀浆仪

实验过程

体外细胞实验：

将DC2.4和RAW264.7细胞与不同浓度的NIV（0.19-5μmol/L）共培养24小时。

收集上清液，通过ELISA检测促炎细胞因子（IL-1β,IL-6,TNFα）的蛋白水平。

提取细胞总RNA，通过qPCR检测相应细胞因子的基因表达水平。

为探究MAPK通路，细胞暴露于NIV 2小时后，通过Western blot检测ERK1/2、p-38和JNK的磷酸化水平。

使用特异性MAPK抑制剂（ERK1/2,p38,JNK抑制剂）预处理细胞1小时，再加入NIV，检测TNFα的产生情况。

体内动物实验：

使用TDI在NC/Nga小鼠上建立AD模型。小鼠背部皮肤和耳廓每周接受TDI涂抹以诱导AD。

同时，通过饮用水给予小鼠不同剂量的NIV（1 ppm或5 ppm），持续4周。

实验期间，每周监测AD评分、耳部和背部皮肤厚度，并用ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪测量经皮水分散失数据（TEWL）。4周后，收集小鼠的背部皮肤、耳廓淋巴结和血清样本。

ASCH VAPOSCAN 经皮水分流失测量仪

口服NIV使TEWL值上升

制备耳廓淋巴结单细胞悬液，使用流式细胞术分析树突状细胞（CD11c+CD40+）、辅助T细胞（CD3+CD4+）和B细胞（CD19+IgE+）的数量变化。

用CD3/CD28抗体磁珠刺激淋巴结细胞，通过ELISA检测上清液中Th2型细胞因子（IL-4,IL-5,IL-13）的释放。

通过ELISA检测血清总IgE水平。

对皮肤样本进行H&E染色，进行组织病理学评估（包括结痂、增生、细胞浸润等）。

通过qPCR检测皮肤组织中IL-4,IL-5,IL-13的基因表达。

实验结论

本研究表明，暴露于NIV能直接刺激抗原呈递细胞的功能。其机制是通过激活MAPK信号通路（ERK1/2,p-38,JNK），促进TNFα的产生。在AD小鼠模型中，口服暴露于接近观察到的不良反应水平（LOAEL）的NIV（5 ppm），会增强局部淋巴结中树突状细胞的增殖和Th2型细胞因子（IL-4,IL-5,IL-13）的分泌，从而加剧AD的临床症状、皮肤增厚和皮肤屏障功能损伤。研究结果提示，NIV可能通过作用于抗原呈递细胞，成为加剧特应性皮炎的潜在环境因素。