武汉大学汤柳研究团队在木犀草素抗特应性皮炎分子机制的研究进展

摘要

来自武汉大学人民医院药学部汤柳和周本宏研究团队在《Drug Design, Development and Therapy》（IF：5.1）期刊上发表了题为“Molecular Mechanisms of Luteolin Against Atopic Dermatitis Based on Network Pharmacology and in vivo Experimental Validation"的研究。该研究通过网络药理学、分子对接与体内实验相结合的方式，探究了木犀草素抗特应性皮炎的潜在分子机制，为木犀草素的临床应用提供了科学依据。

该研究基于网络药理学、分子对接及体内实验验证，揭示了木犀草素抗特应性皮炎（临床以复发性湿疹样皮损和剧烈瘙痒为特征）的潜在分子机制。研究利用TCMSP、STITCH和SwissTargetPrediction数据库筛选木犀草素的潜在靶点；从DisGeNET、GeneCards和TTD数据库收集特应性皮炎相关靶点；通过STRING 11.0数据库和Cytoscape 3.9.0软件构建交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络；进行GO和KEGG富集分析以明确木犀草素抗特应性皮炎的关键通路；在2,4-二硝基氟苯诱导的特应性皮炎小鼠模型中，验证网络药理学预测的治疗效果、候选靶点及信号通路。体内实验验证显示，木犀草素可改善特应性皮炎样皮肤症状，表现为SCORAD评分降低、肥大细胞浸润减少及皮肤屏障功能恢复；此外，木犀草素通过调节Th1/Th2/Th17介导的细胞因子产生恢复免疫平衡，且抑制病变皮肤中JAK2和STAT3的磷酸化。本研究通过网络药理学与实验验证相结合的方式，系统阐明了木犀草素改善特应性皮炎的作用及可能的分子机制，为木犀草素的后续开发及临床应用提供了参考。

研究材料与仪器

材料

2,4-二硝基氟苯、木犀草素、地塞米松、丙酮、橄榄油、乙醇、丙二醇、4%多聚甲醛、苏木精-伊红染色液、甲苯胺蓝染色液、BCA蛋白定量试剂盒、Th1/Th2/Th17相关细胞因子ELISA试剂盒、兔抗FLG、抗p-JAK2、抗p-STAT3一抗、山羊抗兔IgG二抗、DAB染色液、DAPI染色液

实验动物：6周龄雌性KM小鼠

仪器

ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪、游标卡尺、分析天平、组织包埋机、切片机、光学显微镜、酶标仪、离心机、免疫组化染色相关设备、免疫荧光成像设备

ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪

过程

网络药理学分析

1. 靶点筛选：通过TCMSP、STITCH 4.0和SwissTargetPrediction数据库获取木犀草素的潜在靶点，经UniProt数据库注释并标准化基因符号，去除重复及非人类靶点；以“Dermatitis, Atopic"为关键词，从DisGeNET、GeneCards和TTD数据库筛选特应性皮炎相关靶点，去除重复靶点。

2. 交集靶点获取：利用Venny 2.1.0在线工具获取木犀草素与特应性皮炎的交集靶点，即木犀草素抗特应性皮炎的潜在靶点。

3. PPI网络构建与拓扑分析：将交集靶点导入STRING 11.0数据库，构建PPI网络并导入Cytoscape 3.9.0软件可视化；通过CytoHubba插件筛选“Degree"值前20的核心靶点，利用MCODE插件进行模块分析。

4. GO与KEGG富集分析：将交集靶点导入DAVID数据库和OmicShare云平台，进行GO功能和KEGG通路富集分析，筛选Q值＜0.01的条目，可视化前20项结果。

分子对接验证

1. 从PubChem数据库下载木犀草素的3D结构，经PyMOL软件加氢、加电荷后保存为.pdbqt格式。

2. 从PDB数据库获取核心靶点的X射线晶体结构，通过UCSF Chimera 1.14软件去除配体和水分子，添加极性氢原子和Gasteiger电荷。

3. 以木犀草素为配体、核心靶点为受体，利用UCSF Chimera 1.14软件进行分子对接，以结合能评价结合能力。

体内实验验证

1. 动物分组与特应性皮炎模型构建：小鼠适应饲养1周后随机分为4组：正常组、模型组、0.5%木犀草素组、0.05%地塞米松组。建模方法：第1天在小鼠背部脱毛区涂抹100μL 1.0% DNFB致敏；第3、7、11天涂抹100μL 0.5% DNFB激发；从第1天至第13天，木犀草素组和地塞米松组每日背部涂抹对应药物，正常组和模型组涂抹等体积溶媒。

2. 指标检测：

第13天进行SCORAD评分（评估红斑/出血、鳞屑/干燥、水肿/肿胀、糜烂/抓痕，评分0-3分/项），计数10分钟内搔抓次数；第12天用ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪检测TEWL值。

小鼠处死后，分离背部皮肤，用游标卡尺测厚度、分析天平测重量；取皮肤组织固定于4%多聚甲醛，包埋切片后进行H&E染色（检测表皮厚度和炎症细胞浸润）、TB染色（检测肥大细胞浸润），ImageJ软件定量分析。

收集小鼠眼球血，离心获取血清；取100mg皮肤组织匀浆后离心获取上清，BCA法测定蛋白浓度，ELISA试剂盒检测血清和皮肤中Th1/Th2/Th17相关细胞因子水平。

皮肤组织切片经脱蜡、水化、抗原修复等步骤后，进行免疫组化和免疫荧光，ImageJ软件分析平均光密度。

3. 统计分析：采用GraphPad Prism 5.0软件，通过单因素方差分析结合Dunnett事后检验分析数据，P＜0.05或P＜0.01为差异有统计学意义。

结论

木犀草素与特应性皮炎存在 31 个交集靶点，核心涵盖 IL-6、TNF、IL-10、VEGFA、IL-4 等 20 个关键基因，这些靶点主要参与细胞因子应答及相关信号通路，且 KEGG 富集分析明确其抗特应性皮炎的关键通路包括 IL-17 信号通路、Th17/Th1/Th2 细胞分化、JAK/STAT 信号通路等，分子对接也验证了木犀草素与核心靶点的强结合能力。体内实验进一步证实，木犀草素能改善 DNFB 诱导的特应性皮炎小鼠模型的皮肤症状，不仅降低 SCORAD 评分、减少搔抓次数、减轻皮肤水肿（降低皮肤厚度和重量），还能改善组织病理学改变，减少表皮增生和炎症细胞浸润，降低颗粒型与脱颗粒型肥大细胞的浸润数量；同时，它可有效恢复皮肤屏障功能，表现为降低 TEWL 值、上调 FLG 蛋白表达，还能调节免疫平衡，降低 Th2 相关细胞因子 IL-4 及 Th17 相关细胞因子 IL-6、TNF-α、IL-17 的水平，升高 Th1 相关细胞因子 IFN-γ 的水平。而这一系列作用的核心机制在于木犀草素能抑制 JAK2 和 STAT3 的磷酸化，阻断 JAK/STAT 信号通路激活，为特应性皮炎的临床治疗提供了重要科学依据与潜在方向。