ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪助力脂肪胶原片段修复特应性皮炎小鼠研究

2024年10月南方医科大学南方医院整形外科的卢峰和何运凡研究团队，在《Plastic and Reconstructive Surgery》期刊上发表了题为“Adipokine-Enriched Adipose Extract Restores Skin Barrier and Ameliorates Inflammatory Dysregulation in Atopic Dermatitis Mice"（富含脂肪因子的脂肪提取物修复特应性皮炎小鼠皮肤屏障并改善炎症失调）的研究。聚焦于新型富含脂肪因子的产物——脂肪胶原片段（ACF），通过卵清蛋白诱导的特应性皮炎（AD）小鼠模型，探究其是否能通过调节免疫微环境和修复皮肤屏障来缓解AD症状。

摘要

背景

特应性皮炎（AD）是一种发病率较高的慢性皮肤病，其特征为皮肤屏障异常和免疫失调。传统疗法通常受限于副作用和高成本。鉴于脂肪因子具有抗炎和修复特性，其日益被认为是治疗皮肤病的潜在候选药物。脂肪胶原片段（ACF）作为一种新型富含脂肪因子的产物，可能通过调节免疫微环境和修复皮肤屏障来缓解AD。

方法

采用高速匀浆（10,000转/分钟，持续1分钟）和离心（3000×g，持续3分钟）的方法从脂肪组织中提取ACF。将卵清蛋白诱导的AD雌性BALB/c小鼠（6周龄）随机分为两组，分别皮内注射0.2 mL ACF（ACF组）或磷酸盐缓冲盐水（PBS组，阴性对照），同时设置正常小鼠作为正常对照组（n=6）。在AD诱导期结束后（第50天），评估皮肤病严重程度、炎症相关指标（表皮厚度、浸润的肥大细胞数量、辅助性T细胞（Th）型细胞因子表达）以及皮肤屏障相关指标（经表皮失水率、皮肤屏障相关蛋白表达）。此外，通过蛋白质组学分析评估ACF中的生物活性成分。

结果

ACF来源的脂肪因子包含抗炎、皮肤屏障相关和脂质生物合成相关成分。ACF治疗可降低AD皮肤的皮肤病严重程度（6.2±1.8，P<0.0001）、表皮厚度（25.7±12.8μm，P=0.0045）、浸润的肥大细胞数量（31.3±12.4个/视野，P=0.0475）以及Th型细胞因子（干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素（IL）-4、IL-4R、IL-13和IL-17A，P<0.05）的表达。同时，ACF治疗还改善了经表皮失水率（29.8±13.8g/m²·h，P=0.0306）和皮肤屏障相关蛋白的表达（丝聚蛋白：14,258±4375，P=0.0162；兜甲蛋白：6037±1728，P=0.0010；紧密连接蛋白-1：20,043±6406，P=0.0420；闭合小环蛋白-1：4494±1114，P=0.0134）。

结论

ACF通过改善炎症失调和皮肤屏障缺陷，在小鼠模型中改善了AD症状。该疗法需在更高级的动物模型中进一步验证。

实验材料与仪器

材料

1. 实验动物：6周龄雌性BALB/c小鼠；

2. 主要试剂：卵清蛋白、磷酸盐缓冲盐水、Dulbecco改良 Eagle 培养基、TRIzol试剂、逆转录试剂盒、H&E染色试剂、TB染色试剂、4',6-二脒基-2-苯基吲哚；

3. 抗体：抗丝聚蛋白抗体、抗兜甲蛋白抗体、抗紧密连接蛋白-1抗体、抗闭合小环蛋白-1抗体、抗细胞角蛋白16（CK16）抗体及相应二抗；

仪器

高速匀浆机、离心机、ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪、显微镜、激光共聚焦显微镜、Q-Exactive质谱仪、Easy nLC液相色谱系统。

实验过程

1. 实验动物饲养

BALB/c小鼠饲养于25℃无病原体环境中，采用12小时光照/黑暗周期，自由进食饮水。

2. ACF制备

从每只BALB/c小鼠获取约1.5g皮下脂肪组织，用PBS（pH7.4）洗涤两次并切成小块后，使用高速匀浆机以10,000转/分钟匀浆1分钟，随后依次通过0.25mm和0.15mm不锈钢滤网去除大纤维片段。将过滤后的脂肪组织悬液以3000×g离心3分钟，收集沉淀物即为ACF。

3. OVA诱导AD小鼠模型建立与分组处理

选取12只BALB/c小鼠，麻醉后脱毛，用3M Tegaderm胶带对背部皮肤进行6次剥离处理，随后将浸有100μg/100μL OVA/生理盐水溶液的1×1cm无菌纱布敷于背部皮肤并固定，持续1周。每只小鼠进行三次1周的OVA致敏，间隔为两周，整个模型制备周期为49天。在模型制备第28天，将致敏的AD小鼠随机分为两组（每组n=6）：ACF组背部皮肤致敏部位皮内注射0.2mL ACF；PBS组注射0.2mL PBS作为阴性对照；另设6只未进行OVA致敏的小鼠作为正常对照组（NC组）。

4. 检测指标与方法

• AD症状严重程度评估：第50天，对红斑/出血、结痂/抓痕、渗液/糜烂、肿胀/水肿、干燥、苔藓样变6项症状进行评分，每项评分范围为0（无）至3（严重），总分为症状严重程度评分。

• TEWL水平测量：在AD诱导前（第1天）和诱导后（第50天），于室温湿度条件下，用ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪测量小鼠背部皮肤TEWL水平。

ASCH  VAPOSCAN经皮水分流失测量仪

（左）正常对照组（NC）、磷酸盐缓冲液组（PBS）及 ACF 组小鼠背部皮肤的经皮水分流失（TEWL）检测结果（样本量 n=6，均值 ± 标准差）。（右）采用 ImageJ 软件对免疫组化（IHC）染色图像进行定量分析，获得的正常对照组（NC）、磷酸盐缓冲液组（PBS）及 ACF 组皮肤样本中丝聚蛋白、兜甲蛋白、闭合蛋白 1 及紧密连接蛋白 1的表达水平（样本量 n=10，均值 ± 标准差）。P<0.05；P<0.001；****P<0.0001。统计方法采用单因素方差分析结合杜凯检验，同时采用**克鲁斯卡尔 - 沃利斯检验。

• 组织学检查：第50天将小鼠，取背部皮肤，一半固定于10%福尔马林溶液中，石蜡包埋后切成4μm切片，进行H&E染色（评估表皮厚度）和TB染色（计数浸润的肥大细胞），通过ImageJ软件分析图像。

• 定量实时聚合酶链反应（qPCR）：采用TRIzol试剂提取皮肤组织RNA，经逆转录合成cDNA后，以β-肌动蛋白为内参基因，通过qPCR检测Th1型细胞因子（IFN-γ、TNF-α）、Th2型细胞因子（IL-4、IL-4R、IL-13）和Th17型细胞因子（IL-17A）的相对基因表达水平。

• 免疫组化（IHC）与免疫荧光染色：对石蜡切片进行抗原修复后，加入相应一抗和二抗进行IHC染色，通过ImageJ软件半定量分析丝聚蛋白、兜甲蛋白、紧密连接蛋白-1和闭合小环蛋白-1的表达；免疫荧光染色则将CK16抗体与皮肤屏障相关蛋白抗体共孵育，DAPI染核，通过激光共聚焦显微镜观察蛋白共定位情况。

• ACF浸出液制备与蛋白质组学分析：将0.3mL ACF置于3mL DMEM中，37℃、5%CO₂、95%湿度条件下培养72小时，3000×g离心3分钟收集上清液作为ACF浸出液。采用过滤辅助蛋白质组制备酶解方法提取肽段，通过Q-Exactive质谱仪结合Easy nLC进行质谱分析，利用Proteome Discoverer 2.2软件进行蛋白鉴定，Blast2GO软件进行基因本体（GO）注释分析。

5. 统计学分析

实验数据以均值±标准差（mean±SD）表示，采用Kruskal-Wallis检验或单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey检验进行性分析，P<0.05视为差异具有统计学意义，使用SPSS 21.0软件进行统计处理。

实验结论

1. ACF治疗可缓解OVA诱导的AD小鼠模型的皮肤病症状，降低症状严重程度评分，其缓解效果优于部分传统疗法及脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）疗法。

2. ACF能有效减轻AD皮肤的表皮增厚和肥大细胞浸润，使表皮厚度基本恢复至正常水平，减少炎症细胞在皮肤组织中的聚集。

3. ACF可下调AD皮肤中Th1、Th2和Th17型炎症细胞因子的表达，纠正炎症失调，且抑制的细胞因子谱比ADSCs更广泛。

4. ACF能改善AD皮肤的经表皮失水率，上调丝聚蛋白、兜甲蛋白、紧密连接蛋白-1和闭合小环蛋白-1等皮肤屏障相关蛋白的表达，修复受损的皮肤屏障。

5. 蛋白质组学分析证实，ACF含有823种脂肪因子，其中包括26种皮肤屏障相关、37种抗炎相关和41种脂质生物合成相关脂肪因子，这些成分是ACF发挥治疗作用的重要物质基础。

6. ACF作为一种自体来源、制备快速简便、无明显严重副作用的注射用产物，有望成为解决AD的潜在方法，但需在更大样本量的动物模型中进一步验证，并确定治疗剂量后再推进至临床研究。