ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪助力苦杏仁苷改善银屑病实验研究

作为一种由免疫系统紊乱引发的慢性复发性炎症性皮肤病，银屑病的长期干预一直是科研领域的难题。而苦杏仁苷所具备的免疫调节与抗炎性，为这一难题提供了新的解决方向。

2024年12月14日，由广州中医药大学的韩凌研究团队在《Archives of Dermatological Research》期刊上发表了题为“Amygdalin alleviates psoriasis-like lesions by improving skin barrier unction"的研究。该研究通过咪喹莫特诱导的银屑病模型、胶带剥离诱导的皮肤屏障破坏模型，以及体外IL-17A和TNF-α刺激的HaCaT细胞模型，探究苦杏仁苷对银屑病的可能作用及其作用机制，重点分析其对炎症反应和皮肤屏障功能的影响。

摘要

背景：银屑病是一种由免疫系统介导的慢性、复发性炎症性皮肤病。苦杏仁苷具有免疫调节和抗炎作用。

目的：为探究苦杏仁苷对银屑病的潜在作用及其发病机制，本研究检测了苦杏仁苷对咪喹莫特诱导的银屑病、胶带剥离诱导的皮肤屏障破坏的影响，并在体外探究了其可能的作用机制。

结果：在两种动物模型中，苦杏仁苷可减少表皮厚度和炎症细胞浸润，抑制IL-1β、IL-6和TNF-α的产生，并上调丝聚蛋白、兜甲蛋白和角蛋白10的表达。此外，在IL-17A和TNF-α诱导的HaCaT细胞中，苦杏仁苷可抑制IL-6、IL-1β和TNF-α的表达，促进皮肤屏障修复相关蛋白丝聚蛋白、兜甲蛋白和角蛋白10的表达。体内外实验结合表明，苦杏仁苷可调节银屑病中的炎症反应和皮肤屏障功能。本研究还进行了初步的机制探索，发现苦杏仁苷可抑制p38MAPK信号通路的磷酸化。

结论：苦杏仁苷能够缓解银屑病皮损并改善皮肤屏障损伤，该研究为其未来开发成为银屑病治疗候选药物提供了实验依据。

实验材料与仪器

材料

1. 试剂：苦杏仁苷、咪喹莫特乳膏、地塞米松片、IL-1β、TNF-α、丝聚蛋白、兜甲蛋白、兜甲蛋白、角蛋白10引物、pP38抗体、p38抗体、β-微管蛋白抗体、CD3抗体、杜氏改良 eagle 培养基、胎牛血清、3-2,5-二苯基四氮唑溴化物、二甲基亚砜、重组人IL-17A和TNF-α、

2. 实验动物：6-8周龄雄性BALB/c小鼠

3. 细胞：HaCaT细胞

仪器

ASCH  VAPOSCAN经皮水分流失测量仪、光学显微镜、NanoDrop 2000仪器、ViiA7实时PCR仪、Bio-rad成像系统、酶标仪

实验过程

动物实验设计

1. 分组与给药：

IMQ诱导银屑病模型：30只小鼠随机分为6组，分别为对照组、IMQ组、IMQ+DEX组、IMQ+苦杏仁苷低剂量组、IMQ+苦杏仁苷中剂量组、IMQ+苦杏仁苷高剂量组。对照组4只，IMQ组6只，其余组每组5只。连续灌胃10天，对照组和IMQ组给予水，DEX组给予5mg/kg·d的DEX溶液，苦杏仁苷低、中、高剂量组分别给予15mg/kg/d、30mg/kg/d、60mg/kg/d的苦杏仁苷溶液，灌胃体积均为0.2ml。第4至10天，每天在小鼠背部涂抹50mg 5% IMQ乳膏，连续7天构建银屑病样模型。

TS诱导皮肤屏障破坏模型：24只小鼠随机分为6组，每组4只，分组同前。连续灌胃8天，给药方式与剂量同前。第4至8天，每天在小鼠背部粘贴胶带并快速撕下，重复5次（每天2次，间隔8小时，连续5天），直至皮肤发红且无明显出血，构建皮肤屏障破坏模型。第11天，颈椎脱臼处死小鼠，收集背部皮肤病变组织。

2. 检测指标：

PASI评分：根据PASI评分标准，对小鼠背部皮肤的红斑、脱屑、浸润增厚进行0-4级评分，求和得到总评分，并绘制评分趋势线。

经表皮水分流失（TEWL）：从第4天开始，使用ASCH  VAPOSCAN经皮水分流失测量仪检测小鼠背部皮肤表面的TEWL值，每组小鼠背部取3个不同部位检测并取平均值。

ASCH  VAPOSCAN经皮水分流失测量仪

通过采用TS诱导的皮肤屏障损伤模型，观察AMY对小鼠体重、 TEWL 、组织病理学染色及CD3表达的影响。与TS组相比，DEX和AMY组的 TEWL 显著降低，表明AMY能有效防止皮肤水分流失，AMY均能减少皮损处CD3的浸润。上述数据表明，AMY可缓解TS诱导的皮肤屏障损伤。

组织病理学与免疫组化：小鼠皮肤组织在4%多聚甲醛中室温固定24小时，脱水、包埋后切成4μm切片，进行苏木精-伊红（H&E）染色和CD3抗体免疫组化染色，光学显微镜下采集图像。

实时聚合酶链反应：通过Trizol试剂提取皮肤组织总RNA，NanoDrop 2000测定RNA浓度，逆转录合成cDNA，采用SYBR qPCR Master Mix试剂在ViiA7实时PCR仪上进行检测，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

细胞实验设计

1. 细胞培养与分组：HaCaT细胞在含10% FBS的DMEM培养基中，37℃、5% CO2条件下培养。分为4组：对照组、TNF-α+IL-17A组、TNF-α+IL-17A+低剂量苦杏仁苷组、TNF-α+IL-17A+高剂量苦杏仁苷组。苦杏仁苷预处理细胞24小时后，加入20ng/mL IL-17A和20ng/mL TNF-α刺激8小时。

2. 细胞活力检测：对数生长期的HaCaT细胞接种到96孔板，每孔5000个细胞，设置对照组和苦杏仁苷组（浓度分别为10、20、40、80、160、320μM），每组4个复孔。培养12小时后更换含相应浓度苦杏仁苷的培养基或对照组培养基，孵育24小时后，加入MTT溶液孵育4小时，弃去MTT，加入150μL DMSO，振荡10分钟后，酶标仪检测570nm处吸光度。

3. 蛋白质印迹分析：采用含1%磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液提取细胞总蛋白，BCA蛋白测定试剂盒定量蛋白。每样本30μg蛋白经8%丙烯酰胺SDS-PAGE电泳后，转移至聚偏二氟乙烯膜，5% BSA室温封闭1小时，加入兔抗pp38、p38、β-tubulin一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤后，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗室温孵育1小时，TBST洗涤后，加入显影剂，Bio-rad成像系统成像，Image Lab软件分析蛋白表达量。

统计分析

所有数据以均值±标准差表示，采用SPSS 22.0软件分析。方差齐且符合正态分布时采用Bonferroni检验，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验；不符合正态分布的数据采用非参数检验中的Mann-Whitney U法比较。P<0.05认为差异具有统计学意义。

实验结论

1. 苦杏仁苷可缓解IMQ诱导的小鼠银屑病样皮炎，改善皮肤红斑、脱屑、浸润等症状，降低PASI评分，减少经表皮水分流失，减轻表皮增厚、角化过度等病理改变，抑制CD3炎症细胞浸润，下调IL-1β、TNF-α等炎症因子的mRNA表达，上调K10、LOR、IVL等皮肤屏障相关蛋白的mRNA表达，且不影响小鼠脾脏指数，无全身免疫抑制作用。

2. 苦杏仁苷可改善TS诱导的小鼠皮肤屏障损伤，降低TEWL，减少表皮厚度和CD3炎症细胞浸润，下调IL-1β、TNF-α的mRNA表达，上调IVL和K10的mRNA表达。

3. 苦杏仁苷可抑制HaCaT细胞增殖，在TNF-α和IL-17A刺激的HaCaT细胞中，下调IL-1β、TNF-α、IL-6等炎症因子的mRNA表达，上调FLG、K10、IVL等皮肤屏障相关蛋白的mRNA表达，并抑制p38MAPK信号通路的磷酸化。

4. 综上，苦杏仁苷可通过调节炎症反应、修复皮肤屏障功能缓解银屑病皮损，其作用机制可能与抑制p38MAPK信号通路磷酸化相关，为银屑病治疗候选药物的开发提供了实验依据。