Omegawave FLO-C1激光多普勒血流仪探究大鼠下唇副交感神经反射性血管舒张

来自北海道健康科学大学So Kawakamia研究团队，在《BRAIN RESEARCH》期刊发表了一项题为“延髓 GABA 信号转导在下唇副交感反射性血管舒张中的作用"研究。该研究旨在明确三叉神经脊髓核（Vsp）和下涎核（ISN）中γ-氨基丁酸（GABA）及其受体在调节舌神经（LN）诱发的大鼠下唇副交感神经反射性血管舒张中的作用。

摘要

在口腔颌面区域，三叉神经区域口腔颌面结构受到伤害性刺激时，会引发副交感神经反射性血管舒张，这一过程通过三叉神经脊髓核（Vsp）和下/上涎核（ISN/SSN）实现。然而，这些核团内抑制性突触输入所涉及的神经递质此前尚未被描述。异氟醚、七氟醚和氟烷等挥发性麻醉剂的GABA能作用可抑制这种副交感神经反射性血管舒张，提示延髓GABA能机制通过激活GABA受体对副交感神经反射发挥抑制作用。本研究的目的是确定Vsp和ISN中的GABA及GABA受体在调节舌神经（LN）诱发的下唇副交感神经反射性血管舒张中的作用。在乌拉坦麻醉（1g/kg）下，记录颈迷走神经-交感神经切断大鼠经舌神经电刺激后下唇血流的变化。向Vsp或ISN微注射GABA可明显且可逆地减弱LN诱发的副交感神经反射性血管舒张。向Vsp或ISN微注射GABA_A受体选择性激动剂毒蕈碱或GABA_B受体选择性激动剂巴氯芬，可明显且不可逆地降低这种反射性血管舒张，且预先向Vsp或ISN微注射相应受体选择性拮抗剂GABA_A受体选择性拮抗剂甲碘荷包牡丹碱或GABA_B受体选择性拮抗剂CGP-35348可减弱这些作用。单独向Vsp或ISN微注射这些拮抗剂，对该反射性血管舒张无明显影响。此外，向Vsp或ISN微注射毒蕈碱和巴氯芬的混合物（0.3μl/位点），也可明显降低这种反射性血管舒张。这些结果表明，延髓GABA信号转导通过Vsp和ISN中的GABA_A和GABA_B受体抑制大鼠下唇的副交感神经反射性血管舒张。

实验材料与仪器

实验材料

异氟醚、泮库溴铵、乌拉坦、甲碘荷包牡丹碱、CGP-35348、毒蕈碱氢溴酸盐、巴氯芬、六甲铵、滂胺天蓝染料（2%）、生理盐水、4%多聚甲醛、0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.4）、30%蔗糖、硫堇染料、其他化学试剂

实验仪器

立体定位仪、电刺激器、、隔离单元、Statham压力传感器、麻醉气体监测仪、呼吸机、四通道图表记录仪、冷冻切片机、微量注射套管、同心单极电极、显微镜载玻片、微量操作器、Omegawave FLO-C1激光多普勒血流仪

Omegawave FLO-C1激光多普勒血流仪

实验过程

动物准备

实验选用80只体重350-480g的成年雄性Wistar大鼠，以异氟醚诱导麻醉后，皮下注射乌拉坦（100mg/100g体重），并在整个实验过程中根据需要补充，以维持基础麻醉状态。对大鼠进行股静脉插管以便给药，股动脉插管并连接至Statham压力传感器以监测全身动脉血压（SABP）。麻醉后的动物进行气管插管，静脉注射泮库溴铵（初始剂量0.6mg/kg，持续补充0.4mg/kg/h）使其瘫痪，通过气管套管用50%空气和50%氧气的混合物进行人工通气。呼吸机设置为潮气量1.5ml/100g体重，呼吸频率30-40次/分钟，用麻醉气体监测仪监测呼气末二氧化碳浓度，维持在35-40mmHg，同时用加热垫将直肠温度维持在37-38℃。通过捏夹脚趾约2s观察全身动脉血压是否反射性升高，以判断麻醉深度是否足够，若不足则静脉间歇注射100mg/kg乌拉坦。所有实验中，在进行任何刺激前，均双侧切断颈部迷走神经和颈上交感神经干，以分别消除迷走神经对心血管系统的反射作用和交感缩血管纤维对口腔颌面区域的影响。

下唇血流测量

使用Omegawave FLO-C1激光多普勒血流仪监测下唇血流。将探头放置在下唇上，不施加任何组织压力，血流变化通过测量图表上的反应高度进行评估，并持续显示在四通道图表记录仪上。

Omegawave FLO-C1激光多普勒血流仪

（A）向脊髓三叉神经核（Vsp）微量注射氢溴酸蝇蕈醇，对舌神经中枢切断端电刺激所诱发的左血流量（LBF）增加的影响的代表性示例。

（a1）向 Vsp 微量注射蝇蕈醇的效应。

（a2）向 Vsp 微量注射碘甲硫酸荷包牡丹碱预处理 30 分钟后，再向 Vsp 微量注射蝇蕈醇的效应。

（B、C）向 Vsp（B 图）或下牙槽神经（ISN）（C 图）微量注射氢溴酸蝇蕈醇，对 LN 中枢切断端电刺激诱发 LBF 增加的影响的时间进程。

空心圆：向 Vsp（B 图）或 ISN（C 图）微量注射蝇蕈醇的效应；

实心圆：向 Vsp（B 图）或 ISN（C 图）微量注射碘甲硫酸荷包牡丹碱预处理 30 分钟后，再向 Vsp（B 图）或 ISN（C 图）微量注射蝇蕈醇的效应。

舌神经电刺激

使用双极电极电刺激舌神经（LN）的中枢切断端，以诱发下唇副交感神经反射性血管舒张。

Vsp和ISN中下唇血管舒张位点的识别

将动物以平颅位固定在立体定位仪上，进行部分开颅手术。外均用搪瓷绝缘的同心单极电极通过引导套管插入，降低刺激电极直至电刺激引发血管舒张反应，确定Vsp或ISN中的下唇血管舒张位点。通过引导套管插入注射套管，向Vsp或ISN微注射0.3μl/位点的4%以确认LN刺激引发的血管舒张反应是否通过Vsp或ISN介导。

自主神经节阻断剂的使用

使用胆碱能自主神经节阻断剂六甲铵验证ISN电刺激引发的下唇血管舒张的自主性，并将其作为ISN套管植入正确的指标。

延髓GABA能药物微注射

微注射可明显降低同侧LN刺激引发的血管舒张反应的位点，向Vsp或ISN微注射0.3μl/位点的GABA、毒蕈碱或巴氯芬。在单独的实验中，向Vsp或ISN微注射毒蕈碱和巴氯芬的混合物。另外，在微注射毒蕈碱或巴氯芬前30min，向Vsp或ISN微注射0.3μl的甲碘荷包牡丹碱或CGP-35348。在LN诱发的反应从影响中复后20-30min开始实验，将微注射特定药物后获得的LN诱发反应幅度表示为给药前记录的对照反应的百分比。

组织学检查

实验结束时，向Vsp和ISN的注射位点微注射0.3μl的滂胺天蓝染料进行标记。然后给所有大鼠静脉输注过量通过升主动脉灌注200ml生理盐水，随后立即灌注500ml 4%多聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.4）。取出脑干和上颈脊髓，在4℃下保存在含有30%蔗糖的冷缓冲液中4-7天。之后，用冷冻切片机切成50μm厚的切片，收集在0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.4）中，将切片挂载在MAS涂层显微镜载玻片上，并用硫堇染色，以检查电刺激和微注射位点。

统计分析

实验结束后进行重复测量方差分析，随后进行Bonferroni事后检验比较。使用非配对t检验比较甲碘荷包牡丹碱+毒蕈碱组与毒蕈碱组、CGP-35348+巴氯芬组与巴氯芬组之间的差异。数据以平均值±标准误表示，p<0.05被认为具有统计学明显性。

实验结论

本研究结果表明，三叉神经脊髓核（Vsp）和下涎核（ISN）中的GABA_A和GABA_B受体均能抑制下唇的副交感神经反射性血管舒张。口腔颌面区域的副交感神经反射性血管舒张通过位于Vsp和ISN中的GABA_A和GABA_B受体接受GABA能抑制输入。这些发现为通过作用于GABA受体的麻醉剂调节口腔颌面血流提供了新的相关信息，并可能对口腔颌面手术中挥发性麻醉剂的使用具有重要意义。GABA介导的血流减少对于在全身麻醉下进行口腔颌面手术时减少出血似乎具有相当重要的作用，因为挥发性麻醉剂可减少口腔颌面区域受到伤害性手术刺激时引发的副交感神经反射性血管舒张，但仍需进一步研究明确挥发性麻醉剂是否通过这些机制对口腔颌面区域的副交感神经反射性血管舒张发挥抑制作用。