研究进展 | 新型PAR-2抑制剂E6795在特应性皮炎小鼠实验药理学研究

2025年9月，来自京都大学医学研究生院皮肤科等多个机构的Naomi Kitayama研究团队，在《Biochemical and Biophysical Research Communications》期刊上发表了题为“Targeting PAR-2 in atopic dermatitis: Preclinical evaluation of the novel inhibitor E6795"的研究。该研究聚焦于特应性皮炎（AD）的病理机制，对新型蛋白酶激活受体2（PAR-2）小分子抑制剂E6795进行了临床前评估，探究其在改善AD相关炎症、瘙痒及皮肤屏障功能障碍等方面的作用。

摘要

特应性皮炎（AD）是一种慢性炎症性皮肤病，以湿疹样皮损、剧烈瘙痒和皮肤屏障功能受损为特征。尽管新型治疗方法不断涌现，但许多患者仍面临疾病控制不足、治疗成本高及病情复发等问题。蛋白酶激活受体2（PAR-2）在AD皮损中过度表达，在促进炎症反应、瘙痒感产生及表皮稳态失衡中发挥作用。本研究提供了E6795的临床前研究证据，该化合物是一种专为靶向上述病理过程设计的小分子PAR-2抑制剂。激酶和药理学分析证实，E6795可选择性抑制PAR-2，在广泛的激酶和药理学检测面板中显示出极低的脱靶相互作用。此外，E6795在两种小鼠模型中均改善了AD相关终点指标，包括减轻炎症反应和免疫细胞浸润；口服给药降低了经表皮水分流失（TEWL），而2%局部乳膏制剂改善了与屏障功能相关的组织学表现及瘙痒症状。组织学检查证实，E6795治疗后炎症细胞浸润减少，皮肤屏障功能增强。研究结果表明，E6795通过选择性抑制PAR-2信号传导，靶向作用于AD病理生理学的三大支柱——屏障功能障碍、炎症反应和瘙痒。本研究强调了E6795作为一种具成本效益的新型AD局部治疗药物的潜力。

实验材料与仪器

（一）实验材料

1. 实验动物：11-12周龄雄性Nc/Nga小鼠、6-14周龄雌性BALB/c小鼠、6-10周龄雄性C57BL/6J小鼠。

2. 试剂与抗体：MC903、E6795、PAR-2激动肽SLIGKV-NH₂和SLIGRL-NH₂、胰蛋白酶、凝血酶、羧甲基纤维素、二甲基亚砜、乌拉坦、各种荧光标记抗体、FLIPR钙测定试剂、胶原酶II型、DNase I、10%福尔马林、苏木精-伊红染色试剂、甲苯胺蓝染色试剂等。

3. 细胞与组织样本：人胚肾HEK293细胞、健康人皮肤样本、AD患者皮损皮肤样本。

（二）实验仪器

FDSS6000荧光检测系统、FACS Fortessa流式细胞仪、FlowJo软件、厚度计、划痕测量系统、384孔聚丙烯试剂储液板、I型胶原包被透明底黑色384孔板、通风笼、显微镜及图像分析系统、ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪

ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪

实验过程

1. 细胞实验：HEK293细胞在含3%胎牛血清的DMEM培养基中培养，接种于384孔板后负载FLIPR钙测定试剂，加入不同浓度E6795预处理30分钟，再加入胰蛋白酶或凝血酶，通过FDSS6000系统监测120秒内的实时荧光强度，采用四参数logistic模型计算IC₅₀值。

2. 动物模型构建与给药：

￮ MC903诱导AD模型：BALB/c小鼠耳部连续8天局部涂抹MC903，从第4天起，每日口服含E6795的羧甲基纤维素混悬液，对照组给予相应溶媒。

￮ Nc/Nga严重AD模型：将患有皮炎的Nc/Nga小鼠分为5组，每日局部涂抹 E6795乳膏，持续7天，设未处理组作为生物学对照。

3. 药效学评估：

皮肤屏障功能：通过ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪测量第0、3、7天的经表皮水分流失值（TEWL）；使用厚度计每日测量小鼠耳厚度。

ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪

（c）第 3 天和第 7 天的经表皮失水量（TEWL）检测结果。与溶媒对照组相比，E6795 口服给药在第 7 天可明显降低 TEWL。数据以均值 ± 标准误表示（除第 8 天口服给药组 n=3 外，其余各组 n=4）。* 校正后 P < 0.05，与溶媒对照组相比（邓尼特检验）

￮ 瘙痒行为检测：在第7天17:00至次日07:00，将小鼠单独置于测量笼中，经2小时适应期后，通过划痕测量系统记录12小时内的搔抓行为频率。

￮ 组织学与免疫组化分析：实验终点收集小鼠耳部皮肤组织，经甲醛固定、石蜡包埋后制作5μm切片，进行H&E染色（观察炎症细胞浸润和表皮厚度）、甲苯胺蓝染色（计数肥大细胞）及PAR-2免疫组化染色；人皮肤样本同样进行PAR-2免疫组化检测。

￮ 流式细胞术分析：小鼠耳部皮肤组织经酶解制备单细胞悬液，用荧光标记抗体染色后，通过FACS Fortessa检测嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、CD4⁺T细胞、嗜碱性粒细胞等免疫细胞亚群的浸润情况，结果以每平方毫米耳皮肤的绝对细胞数表示。

4. 药代动力学研究：检测小鼠体内E6795的血浆游离分数、全血游离分数及血-浆比，评估其全身吸收和分布特征。

5. 选择性分析：通过激酶选择性面板和CEREP药理学结合面板，检测1μM和10μM浓度下E6795对多种激酶、受体、离子通道的抑制作用，评估其脱靶活性。

6. 统计学分析：使用GraphPad Prism 7.03软件，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett多重比较检验，以α=0.05为检验水准，数据以均值±标准误（mean±SEM）表示。

实验结论

1. E6795具有强效且选择性的PAR-2抑制活性，细胞钙通量测定中其IC₅₀值为6.56nM，对PAR-1无抑制作用，且在广泛的激酶和药理学面板中脱靶活性极低。

2. 药代动力学显示E6795口服可吸收，虽血浆蛋白结合率高达97.5%，但少量游离药物即可发挥治疗作用。

3. 免疫组化证实AD患者角质形成细胞中PAR-2表达较健康人升高。

4. 在MC903诱导的AD小鼠模型中，E6795口服和局部给药均能减少嗜酸性粒细胞浸润，口服给药可降低TEWL、改善皮肤屏障功能，局部给药能减轻耳厚度。

5. 在Nc/Nga AD小鼠模型中，2% E6795乳膏可减少表皮厚度、肥大细胞浸润及搔抓行为，改善皮炎相关组织学表现。

6. E6795通过选择性抑制PAR-2信号，靶向AD病理生理学的三大核心（炎症、瘙痒、屏障功能障碍），具有作为成本效益高、微创局部治疗药物的潜力。