实验研究 | 上样量多少对睾酮软膏体外透皮试验的经皮吸收数据影响

实验研究 | 上样量多少对睾酮软膏体外透皮试验的经皮吸收数据影响

引言：

韩国檀国大学Jueng-Eun Im、Kyu-Bong Kim团队联合韩国食品药品安全评估院等机构，在《Pharmaceutics》（2021年，Vol.13, IF=6.525）发表研究，通过Biox AquaFlux™ AF200和Hanson Franz扩散池系统，明确了应用量对睾酮体外皮肤吸收的影响，提出了风险评估所需的应用剂量。

摘要：

化学品的皮肤吸收是风险评估的重要因素。本研究探讨了不同应用量对皮肤吸收的影响，并提出了适宜的应用剂量以实现可靠的皮肤吸收。选用cafe和睾酮作为测试化合物，采用Franz扩散池进行体外皮肤吸收试验。将含1%cafe和0.1%睾酮的半固体（乳膏）和液体（溶液）制剂，以不同用量（5、10、25、50毫克或微升/平方厘米）分别应用于大鼠和微型猪（Micropig®）皮肤。

24小时后，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）或高效液相色谱（HPLC），测定皮肤表面、角质层、真皮与表皮及受体液中两种化合物的浓度。结果显示，在大鼠和微型猪两种皮肤类型，以及乳膏和溶液两种制剂中，两种化合物的皮肤吸收率均随应用量增加而下降。尤其在50毫克（或微升）/平方厘米用量下，两种化合物在大鼠和微型猪皮肤中的吸收率，均显著低于5或10毫克（或微升）/平方厘米用量组。因此，为获得保守的皮肤吸收数据，应采用低剂量（5或10毫克/微升/平方厘米）的制剂进行应用。

体外Franz扩散池设备：

所有大鼠和微型猪（Micropig®）皮肤膜均以真皮面朝下的方式，安装在Franz扩散池中。该设备配置Vision Microette自动进样器、循环水浴锅、搅拌板、搅拌控制器及自动补液功能（美国加利福尼亚州查茨沃思市汉森公司）。受体液（RF）室体积为12毫升，水浴锅温度设定为32.5℃，通过水循环维持受体液恒温。受体室中分别装入pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）和含6%（体积分数）聚乙二醇（PEG）的PBS，分别作为睾酮测试的受体液。

皮肤膜解冻至室温后安装到Franz扩散池上，并用生理盐水水合。使用前，采用英国Biox AquaFlux经皮水分流失测量仪评估皮肤膜完整性。暴露1.77平方厘米的皮肤区域，分别将含1%cafe或0.1%睾酮的乳膏或液体制剂，按5、10、25、50毫克/平方厘米或5、10、25、50微升/平方厘米的用量涂抹于暴露区域。涂抹时，通过无菌注射器向供给室注入约8.85、17.7、44.25和88.5毫克（或微升）的制剂，以保证实验条件适宜。仅将扩散池标准顶部组件固定在皮肤膜上，减少采样过程中的反向扩散。

（Biox AquaFlux经皮水分流失测量仪）

随后，用新鲜受体液冲洗自动进样器后，采集200微升受体液样品，采样时间设定在涂抹后0、1、2、4、8、12和24小时。用BD™酒精棉片将残留制剂冲洗三次，棉片收集于提取溶剂中（cafe用40毫升50%（体积分数）甲醇，睾酮用20毫升甲醇），全程为每个测试收集冲洗样品（WASH）。用思高胶带剥离皮肤表面15次，获取角质层（SC）上的残留制剂样品。将使用过的皮肤膜用手术剪剪成8块，置于适宜溶剂中提取（cafe用20毫升50%（体积分数）甲醇，睾酮用10毫升甲醇），得到皮肤样品（SKIN）。总吸收率按皮肤样品和受体液样品中测得的睾酮总量，与涂抹的睾酮总用量的比值计算。

结论：

总之，为获取用于暴露风险评估的保守皮肤吸收数据，建议乳膏制剂采用5或10毫克/平方厘米的剂量，液体制剂采用5或10微升/平方厘米的剂量。该剂量范围与现有法规中的剂量要求相近或更为宽松。根据韩国化妆品人体表面积使用统计数据，该建议剂量范围也处于韩国各类化妆品每表面积每日用量（0.005714–18.75毫克/平方厘米）及欧洲同类用量（0.01086–15.63毫克/平方厘米）之内，因此所选应用条件具有实际可行性。

本研究采用Franz扩散池进行皮肤吸收测试，该方法可作为动物替代测试方法应用于化妆品研究。所用微型猪（Micropig®）剩余皮肤作为实验供体，相较于大鼠皮肤体外测试方法，在动物伦理方面更具优势。

本研究结果有望适用于其他药物，即其他药物可能呈现相似趋势。通常，皮肤吸收率以“渗透量"占“应用量"的百分比计算，且已知化学物质在无限剂量条件下的渗透量会趋于恒定。

因此，若对其他药物采用足够高的应用量（即无限剂量）进行皮肤吸收测试，其渗透量将保持恒定，仅应用量增加，皮肤吸收率预计会下降。Frasch等人也提出，化学物质的应用负荷对皮肤吸收率影响显著。

本研究有望为化妆品、药品及各类化学物质的监管提供参考。但本研究存在局限性：仅使用了两种测试物质。若能采用具有不同辛醇-水分配系数（LogKow）值的测试物质进行多组结果对比，或将研究重复次数增加，将有助于减少数据离散度、提高数据一致性。

参考文献：

【1】Im, J.-E., Kim, H.Y., Lee, J.D., et al. Effect of Application Amounts on In Vitro Dermal Absorption Test Using Caffeine and Testosterone. Pharmaceutics, 2021, 13(5), 641.

【2】OECD. Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. 2004.

【3】Lehman, P.A., Raney, S.G., Franz, T.J. Percutaneous absorptionin man: In vitro-in vivo correlation. Skin Pharmacol. Physiol., 2011,24(5), 224-230.